RECOLECCIÓN DE FRACCIONES DIRIGIDA POR MASAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA FLASH EN FASE REVERSA ACOPLADA AL SISTEMA EXPRESSION CMS

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Author: Equipo Aplicaciones Advion Interchim Scientific

Introducción

La Aplicación siguiente comparará el uso de un sistema de Cromatografía Flash con detector UV frente al mismo sistema combinado con un Espectrómetro de Masas.

Los datos destacan el impacto en la eficiencia del flujo de trabajo y subrayan la importancia de seleccionar el divisor adecuado..

Ejemplo n.º 1: Purificación solo a partir de la señal UV

Advion Interchim Scientific® puriFlash XS 530, equipado únicamente con un detector UV (figura 1), se utiliza para monitorizar los compuestos que eluyen basándose en la absorción de luz ultravioleta por parte de los grupos cromóforos.

Estos grupos (como los dobles enlaces conjugados o los grupos aromáticos) absorben la luz a longitudes de onda específicas.

Figura 1. puriFlash® XS530 UV

Método

Configuración Experimental (Ver Figura 2)

  • Sistema de cromatografía flash: puriFlash® XS 530 con detector UV (200–400 nm)
  • Columna: puriFlash® Column 15 μm C18-HQ F0080, 34 mL/min
  • Muestra:
  •  mezcla de 1 mL (5 compuestos, 20 mg/mL cada uno)

Figura 2: El software puriFlash® InterSoft® X, mostrado aquí, controla todo el flujo de trabajo para la detección UV y la recolección de fracciones.

Resultados

Figura 3: Señal UV a 254 nm para la recolección

Figura 3: Izquierda: Detección y recolección a 254 nm UV. Derecha: Soporte de recolección correspondiente a la purificación a partir de la señal UV.

Los compuestos se recogen en 15 tubos de 25 ml. Cada fracción recogida será analizada mediante LC/MS (Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas) en otro laboratorio. El análisis por LC/MS tras la purificación mediante Cromatografía Flash es un paso clave para verificar la pureza e identidad de los compuestos aislados, pero requiere tiempo para la preparación de las muestras y el análisis.

Ejemplo n.º 2: Purificación a partir de la señal MS

Vamos a realizar la misma separación con Advion Interchim Scientific® expression® CMS acoplado al sistema Flash puriFlash® XS 530 (Figura 4) para la recolección de fracciones dirigida por masa. Normalmente, se utiliza un detector UV para monitorizar los compuestos que eluyen. Una limitación del detector UV es que depende de que los compuestos tengan un cromóforo en su estructura química; por lo tanto, un analito de interés podría no ser detectable si carece de un cromóforo UV adecuado o si eluye junto con otro compuesto.

Además, los sistemas de disolventes pueden interferir y dificultar la absorbancia UV. CMS (Compact Mass Spectrometer) proporciona la máxima sensibilidad, identificando de manera inequívoca materiales de partida residuales, iones del producto deseado, subproductos y contaminantes por su peso molecular, incluso en presencia de compuestos que eluyen simultáneamente y picos de disolvente.

Inyección FIA

Para identificar por masa los compuestos de interés presentes en nuestra mezcla a purificar, realizaremos un análisis por inyección en flujo (FIA). Para ello, se diluye una porción de la mezcla y se introduce mediante jeringa en el Expression® CMS a través de la válvula de inyección frontal del sistema. El software integrado puriFlash® InterSoft® X permite programar directamente los parámetros de la fuente de iones del espectrómetro de masas desde la misma interfaz. Están disponibles tanto ESI como APCI, en modos de ionización positiva o negativa (fig. 5.1 y 5.2).Figura 5.1: Identificación de nuestros primeros compuestos de interés m/z 222

 Figura 5.2: Identificación de nuestro segundo compuesto de interés m/z 372

Método

Configuración Experimental (Ver Figura 6)

  • Sistema de Cromatografía Flash: puriFlash® XS 530 con detector UV (200-400 nm)
  • Espectrómetro de Masas: expression® CMS
  • Divisor puriFlash MS: bomba de compensación 0,1 ml/min, bomba de dilución 0,5 ml/min, válvula 1,5 s
  • Disolvente: Acetonitrilo + 0,1 % de ácido fórmico
  • Columna: puriFlash® Columna 15 μm C18-HQ F0080 34 mL/min
  • Muestra: Mezcla de 1 mL (5 compuestos a 20 mg/mL cada uno)

Figura 6: El software puriFlash® InterSoft® X, que se muestra aquí, controla todo el flujo de trabajo para la recolección de fracciones dirigida por masa, incluyendo la operación y la gestión de datos desde el espectrómetro de masas.

Figura 7:
Parámetros de la fuente APCI y del divisor del espectrómetro de masas (MS):

Los parámetros de la fuente de iones y del divisor del espectrómetro de masas se pueden programar directamente en el panel del método.

Resultados

Señal UV a 254 nm para visualización y XIC de 2 compuestos para recogida (Figuras 8.1 y 8.2

Figura 8.1: Señales UV 254 nm, XIC 371-374 m/z, XIC 272-275 m/z, XIC 220-224 m/z

Figura 8.2: Señales XIC 371-374 m/z, XIC 220-224 m/z

La sincronización entre la señal UV y las señales de masa es perfecta, y los compuestos se recogen en solo 4 tubos de 25 ml (Figura 9).

No es necesario realizar otros análisis; la visualización del espectro de masas de cada pico está disponible directamente en el software ISX (Figura 10).
La recolección de fracciones dirigida por masas acelera enormemente el flujo de trabajo del químico, brindando confianza en el contenido y la pureza de las fracciones recolectadas al eliminar TLC’s fuera de línea, trabajos de preparación y ensayos de LC/MS en el laboratorio central.

Importancia del Divisor (Splitter)

Divisor MS vs Divisor dinámico estándar (Figura 11):

Se ha realizado la misma purificación con una válvula divisor dinámico estándar (la más común en el mercado). La contrapresión generada por este divisor fue superior a 20 bares (presión máxima que puede soportar la columna), por lo que el sistema detectó una sobrepresión que no se puede solucionar ni siquiera disminuyendo el caudal.

Figura 11: El divisor de MS incluye bombas de compensación (Make-Up) y dilución, frente a la válvula divisora dinámica estándar sin bomba de compensación ni dilución

Debido a la contrapresión generada, se vuelve difícil o imposible trabajar con una columna flash con un caudal superior a 25 ml/min.
Gracias a la innovadora tecnología del divisor MS, no se genera ninguna contrapresión, incluso si el caudal es alto. Puedes trabajar con todo tipo de dimensiones de columna y con todos los sistemas puriFlash® 5.
La post-dilución integrada en esta interfaz permite la inyección de muestras sin limitaciones de concentración y sin riesgo de saturación del detector.

Conclusión

El alto caudal y el eluato altamente concentrado de un sistema de Cromatografía Flash se muestrean de manera continua mediante el divisor MS, se diluyen y se introducen en el CMS (Compact Mass Spectrometer) con un disolvente compatible con MS.

Se detecta la relación masa-carga (m/z) de cada compuesto y se correlaciona con los picos de UV.

Los dos productos objetivo se recogen en función de un ion fragmento común.

La accesibilidad y capacidad de los sistemas Advion Interchim Scientific® expression® CMS y puriFlash® hacen que estos instrumentos sean la opción preferida para químicos sintéticos orgánicos y medicinales que desean una identificación definitiva de sus compuestos mientras optimizan las separaciones cromatográficas.

Cómo contactar con Cromlab

Para cualquier información adicional u oferta de productos contacte con nuestro Departamento Comercial.

Advion e Interchim se han unido recientemente. Obtenga más información sobre los beneficios de la espectrometría de masas combinada y la cromatografía Flash en su nota de prensa: https://www.advion.com/advion-interchim-combination/